Aplikace molekulární biologie v lesnictví - molekulární markery
Libor Jankovský, Jakub Šmerda
Dvacáté století je reprezentováno obrovskou akcelerací nových vědních oborů, které záhy našly rozsáhlé uplatněním v řadě aplikovaných disciplín a staly se běžnou součástí každodenního života civilizace. Prudký rozvoj disciplín předstihl prognózy a mnohdy zaskaočil i odbornou veřejnost. Jednou z takových disciplín je molekulární biologie, která se rychle přesunula z laboratoří špičkových pracovišť do každodenního života.
Molekulární biologie
Molekulární biologie vznikla v 50. letech minulého století a u jejího zrodu stáli pánové J. D. Watson a F. Crick, kteří popsali strukturu DNA.
Molekulární biologie se zabývá stavbou a vztahem biomolekul k funkcím a vlastnostem organismů. Z této nepříliš srozumitelné definice vyplývá, že podstata životních dějů spočívá v interakcích mezi nukleovými kyselinami a proteiny. Molekulární biologie tedy studuje fyziologické a morfologické procesy na úrovni “zapínání” a “vypínání” genů a zajímá se také o to, kdo (resp. co) drží prst na tomto genetickém spínači.
Předností tohoto mladého vědního oboru je, že není úzce specializován a zahleděn sám do sebe, ale využívá poznatků jiných vědních oborů a uvádí je do nových souvislostí. Klasické biologické disciplíny umožnily odpovědět na otázky, jak fungují organismy, ale proč tak fungují, poodhalila až molekulární biologie.
Pomineme-li širokou problematiku teoretického výzkumu a zúžíme okruhy studovaných témat na témata využitelná v lesnické praxi, nutně musíme narazit na “kapitolu” molekulární markery.
Molekulární markery
Molekulární markery (značky, ukazatele) jsou pro vědce přibližně to, co otisk palce pro kriminalistu. Jednotlivé “papilární linie” umožňují identifikaci organismu, resp. jeho genetických vlastností; stanoví příbuzenské vztahy mezi organismy; podají informaci o zdravotním stavu organismu apod.
Dříve se jednalo především o proteinové (izoenzymové) molekulární markery a v dnešní době se stále častěji využívá DNA markerů. DNA markery jsou variabilnější, mohou pokrýt (charakterizovat) celý genom organismu a na rozdíl od proteinových markerů nejsou tak významně ovlivněny prostředím.
Velkou výhodou DNA markerů je rychlost a spolehlivost determinace. Například v případě potřeby stanovení patogenního agens z vegetativního vzorku je zapotřebí při kultivačních metodách minimálně 2-3 týdnů. Při imunologických testech pak tato doba činí včetně přípravy vzorku cca 24 hodin, u polymerázové řetězové reakce je možno tuto dobu zkrátit na 2-4 hodiny. Rovněž v souvislosti s využíváním explantátových kultur pro uchovávání genofondu a přípravu sadebního materiálu bude nutná kontrola deklarovaných vlastností.
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Zřejmě nejvyužívanější metodou současné molekulární biologie je PCR (Polymerase Chain Reaction) a i většina metod studia DNA markerů se odvozuje právě od standardní PCR.
PCR je cyklovaná reakce o třech teplotních fázích, při které termostabilní DNA polymeráza namnoží úsek mezi dvěma specifickými oligonukleotidy (primery). V průběhu každého cyklu dochází postupně k denaturaci (rozvolnění dvoušroubovicové molekuly DNA), nasedání (anealaci) primerů a prodlužování (extenzi) řetězce. Po 30 cyklech je úsek mezi primery namnožen 230.
Příprava materiálu pro reakci z dodaného materiálu (rostlinných pletiv nebo živočišných tkání) jsou extrahovány nukleové kyseliny. Do reakční směsi lze přímo dodávat hrubý extrakt. Purifikace (očištění) nukleových kyselin od proteinů a sacharidů není nezbytně nutná. Pro reakci je potřeba 50–100 ng DNA - v ideálním případě je tedy možné např. identifikovat patogenní organismus z několika buněk!
Vizualizace PCR produktu - používá se tzv. elektroforézy, kdy elektrický proud procházející gelovým nosičem strhává nukleové kyseliny. K separaci PCR produktů dochází díky rozdílné pohyblivosti molekul v závislosti na jejich molekulové hmotnosti (u DNA v závislosti na počtu páru bází) - kratší molekuly s nižší molekulovou hmotností jsou pohyblivější než delší. Výsledky lze fotografovat a archivovat.
Nejznámnější DNA markery
RFLP (Restriction Fragment Lenth Polymorphism) - v průběhu evoluce docházelo k bodovým mutacím. Tyto mutace lze odhalit štěpením genomové DNA restrikčními enzymy (restrikční enzym je DNA endonukleása, která vyhledá, rozpozná a štěpí specifickou kombinaci 4-8 nukleotidů (sekvenční motiv)) a elektroforetickým rozdělení obdržených fragmentů. Po porovnání počtu a velikosti fragmentů lze usuzovat na příbuznost analyzovaných genomů.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - metoda odvozená od PCR. Narozdíl od PCR však nevyžaduje znalost cílové sekvence DNA. Reakce probíhá díky náhodnému nasedání krátkého oligonukleotidu (primeru) na analyzovanou genomovou DNA. Soubor amplifikovaných úseků je charakteristický pro jednotlivé druhy, variety, odrůdy.
AFLP (Amplified Fragment Lenth Polymorphism) - po naštípání genomové DNA restrikčními enzymy se na přečnívající konce vzniklých fragmentů připojí (naligují) specifické adaptéry. Po ligaci následuje PCR s primery komplementárními s adaptéry.
Pro RFLP,RAPD a AFLP markery se vžil souhrnný název DNA fingerprinting (DNA otisk).
Mikrosatelity - jsou 2-6 nukleotidové sekvenční motivy v 5-40 opakováních nepřesahující délku 100 párů bází). V důsledku mutací se může snižovat nebo zvyšovat počet opakování (repetic). Po namnožení (amplifikaci) mikrosatelitu pomocí PCR a elektroforetickém rozdělení, se rozdíly v délce fragmentů používají k určení nejrůznějších parametrů populací i jednotlivých organismů - heterozygosity, genetické vzdálenosti, stupni imbreedingu, četnosti alel atd.
Výběr vhodného a spolehlivého markeru, který poskytuje reprodukovatelné výsledky, není snadný a je nutno mu věnovat poměrně mnoho času a úsilí.
Molekulární markery v lesnictví
- Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod.)
Pomocí PCR a druhově specifických primerů lze velmi rychle identifikovat a determinovat cizorodý organismus. Tato metoda se již prosadila v zemědělství a ve šlechtění rostlin. Rovněž v ČR existuje společenská objednávka pro řešení problémů spojených s determinací karanténních organismů, mykorrhizy, degradace dřeva in situ v budovách apod., v rámci lesnického výzkumu i praxe.
- Příbuzenské vztahy a původ
Metody molekulární biologie nabízejí možnosti rozlišení druhů, variet, odrůd na základě analýzy DNA. Ke studiu se především využívají metody DNA fingerprintingu, ale i mikrosatelitů, porovnávání sekvencí intronů genů apod. Do budoucna lze počítat s praktickým upotřebením ve šlechtění lesních dřevin, školkařství, zakládání lesů, v arboristice pro kontrolu původu dovážených sazenic apod.
- Deklarace vlastností sadebního materiálu
DNA markery mohou v předstihu podat informaci o vlastnostech sadebního materiálu (např. odolnosti proti mrazu), případně náchylnosti/odolnosti k některým chorobám apod.
- Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy
Každá rostlina reaguje na stres aktivací (expresí) příslušných genů, resp. tvorbou stresových proteinů (např. odezvu na teplotní abnormality, odezva na zvýšený obsahu těžkých kovů v půdě apod.). Molekulární markery v tomto případě mají diagnostický a prognostický význam. Umožňují včas zachytit počáteční stádia působení stresových faktorů, kdy se ještě jejich vliv morfologicky neprojevil na rostlině nebo porostu. Významné mohou být i pro následné monitorování vývoje poškození.
Nároky na laboratorní vybavení
Pro potřeby aplikace základních metodik, založených především na bázi PCR, je nutno vybavit laboratoř přístrojovým vybavením v min. hodnotě cca 400–600 tis. Kč. Toto základní vybavení zahrnuje PCR termocycler, centrifugu, elektroforézu, transiluminátor a některé další přístroje. Vybavení pro specializovaná pracoviště molekulární biologie se však pohybují v desítkách miliónů Kč. Nákladné jsou i počáteční náklady na chemikálie zhruba ve výši několika set tisíc korun.
Praktické aplikace molekulární biologie v lesnických disciplínách
V každodenním lesnickém provozu je řešena řada často velmi sporných situací, jejichž řešení je klasickými postupy buď zcela nemožné, nebo velmi obtížné a zdlouhavé a průkaznost výsledků sporná. Aplikací uvedených postupů je možno například velmi rychle ověřit původ rostlinného materiálu, přítomnost deklarovaných mykorrhizních symbiontů, rychlá a především exaktní determinace patogena bez potřeby tvorby fruktifikačních orgánů. Další aplikace jsou uvedeny v tab. 1.
Reflexe ve výzkumu a vysokoškolské výuce
Principy molekulární biologie se prolínají do jednotlivých disciplín lesnictví. V ČR prozatím není etablováno specializované pracoviště, zaměřené na aplikace molekulární biologie pro potřeby lesnického výzkumu a provozu. Úkoly jsou v současnosti až na výjimky řešeny v rámci spolupráce s laboratořemi i mimo tento obor. Příčin je několik. Vedle finanční náročnosti na zařízení a provoz laboratoře je to i přes naprosto nesporné přínosy především nedůvěra v novou disciplínu ze strany tradičně konzervativního lesnictví. Problémem je rovněž nedostatek lesnicky vzdělaných specialistů v této disciplíně.
Očekávaný vývoj
V současné době je u nás využití molekulární biologie v lesnictví považováno spíše za záležitost teoretického výzkumu. Dle zkušeností ze zahraničí je možno v horizontu několika let očekávat dynamický rozvoj molekulární biologie v lesnictví a rychlý přechod do oblasti výzkumu aplikovaného, resp. servisní činnosti díky vytvoření rutinních metodik. I z tohoto pohledu je nutné, aby v rámci servisní činnosti pro vlastníky lesů i státní správu fungovala referenční laboratoř, schopná řešit potřebné problémy v této oblasti.
Adresa autorů:
dr. Ing. Libor Jankovský
Ústav ochrany lesů a myslivosti,
LDF MZLU v Brně,
Zemědělská 3, 613 00 Brno
Jakub Šmerda
Ústav botaniky a fyziologie rostlin,
Fakulta agronomická MZLU v Brně,
Zemědělská 1, 613 00 Brno